Значение выяснения факторов, или условий, определяющих развитие тканевых структур, в наших знаниях об организме не требует разъяснений. В данном случае замечания касаются не состояния генома, а факторов среды, в которой развиваются вегетативные нейроны и ганглии у зародыша. Насколько данная область знаний важна и необходима, настолько она и не разработана. В медицинской практике известны случаи недоразвития или отсутствия вегетативных узлов в некоторых органах (например, в толстой кишке при болезни Гиршпрунга), торможение развития центральной нервной системы, приводящее к кретинизму, в условиях недостаточной функции щитовидной железы у детей и пр. Поэтому естественен интерес исследователей к выяснению причин, регулирующих развитие нейронов. Некоторые наблюдения, проведенные в этом плане, дали заслуживающие внимания результаты. В частности, выяснилось, что одним из ранних факторов дифференцировки симпатобластов, обусловливающих миграцию клеток из ганглиозных валиков, является взаимодействие эмбриональных зачатков. Возможно, способность клеток, мигрирующих из нервного зачатка, накапливать катехоламины обусловлена не только эндогенными факторами, но и влиянием материала, возле которого происходит миграция.
Клетки выселяются из нервного валика тотчас после его образования, что давно известно (Holmdahl, 1928, цит. по Batten, 1957). При этом они не рассыпаются во все стороны, а смещаются определенным образом. В голове зародыша потоки валиковых клеток устремляются к глазу, а также к жаберным карманам и дугам. В туловище потоки клеток направляются дорзолатерально (к эктодерме) и нейтрально, в сторону аорты и будущим местам спинномозговых ганглиев, Weston (1963), Weston a. Batler (1966) точно показали эти два направления мигрирующих клеток. Авторами использован радиоавтографический метод. Куриным зародышам вводился меченный тритием тимидин. Через некоторое время кусочек нервного валика с прилежащей нервной трубкой от этих зародышей-доноров пересаживался в изотопический участок зародышей-хозяев.
Причина выселения клеток из валика неясна. Возможно, это функция самих выселяющихся клеток: изменение их адгезивных свойств (Jacobson, 1978, и др.), синтез большого количества гиалуроновой кислоты и выделение ее в межклеточную среду. Иначе говоря, сами клетки создают свое окружение, условия в которых они начинают миграцию (Weston, Derby, Pintar, 1978; Pintar, 1978). В области нервного валика определяется много гиалуроновой кислоты. Предполагается, что это одно из условий начала миграции. Далее валиковые клетки попадают в мезенхиму, которая имеет свой экстрацеллюлярный матрикс. Важным компонентом матрикса является глюкозаминогликаны (GAG), количество и качество которого разное в разных зачатках. Типы GAG определялись указанными авторами в тканевой культуре по включению меченного тритием глюкозамина. Оказалось, что клетки нервного валика, сомитов и эктодермы синтезируют гиалуроновую кислоту и хондроитин-сульфаты. При этом клетки сомитов и эктодермы, в отличие от клеток нервных валиков, меченый глюкозамин включают преимущественно в сульфатные соединения, а не в соединения с гиалуроновой кислотой. Это свидетельствует о химическом различии клеточного матрикса в нервном валике и других зачатках, между которыми движутся мигрирующие клетки. Таково начальное окружение для клеток, выходящих из нервного валика.
Валиковые клетки плюрипотентны. Не определено в них и направление их миграции. Локализация и фенотип этих клеток зависят от окружающих условий во время миграции. Об этом свидетельствуют гетеротопические пересадки участков нервного валика перепела куриному зародышу (Le Douarin a. Teillet, 1974). При пересадке валика вагусного уровня (1-7-й сомиты) в стволовой (тораколюмбальный, trunk) уровень (18-28-и сомиты) развивались клетки надпочечника, т.е. соответственно уровню выселения. Пересадка валика из стволового уровня в вагусный заканчивалась вселением клеток в кишку. Кроме того, авторы культивировали участок прямой кишки (куриный зародыш), в рассеченную стенку которого помещался участок нервного валика перепела (стволовой уровень). В результате в интрамуральном сплетении обнаружены клетки перепела. Авторы пришли к заключению, что клетки-предшественники нейронов вегетативных узлов дифференцируются в холинергические нейроны независимо от уровня нервного валика (вагусный или тораколюмбальный - truncal), из которого они происходят. Направление дифференцировки нейрона определяется местными условиями, окружающими клетку (Smith, Соchard a. Le Douarin, 1977). Авторы пересаживали нервный валик с прилежащим участком нервной трубки из грудной области перепела в более краниальную область (вагусный уровень) куриного зародыша. Оказалось, что клетки, мигрировавшие из их нового места, образуют кишечные ганглии, как при нормальном развитии элементы вагусного уровня. С другой стороны, валиковые клетки вагусного участка, трансплантированные в грудную область, мигрируют в надпочечник, где и дифференцируются в хромаффинные клетки. Эксперименты Leikola (1976) показали, что клетки перепелиного нервного валика, трансплантированные в целомическую полость куриного зародыша, мигрируют в мезенхиму дорсально и объединяются с ганглиями реципиента. В экспериментах in vitro, отмечает Leikola, валиковые клетки рассеиваются. Автор справедливо отмечает, что, видимо, для их дифференцировки важно окружение.
После миграции клетки биохимически оказываются детерминированными. В процессе миграции и дифференцировки симпатобластов из их предшественников происходит последовательное появление нескольких ферментов, необходимых для синтеза катехоламинов (норадреналина). Первый фермент (тирозин-гидроксилаза) в клетках нервного зачатка присутствует на 1-й день инкубации (с 29 часов начинается миграция), второй энзим (ароматическая l-аминокислота) появляется на 2-й день инкубации, уже после начала миграции валиковых клеток. Терминальный энзим (допамин-b-гидрохсидаза) появляется на 4-е сутки инкубации, когда ганглиозные клетки находятся на месте первичного симпатического ствола, и катехоламины могут быть определены цитохимически (Ignarro a. Shideman, 1968).
Клетки симпатических ганглиев, таким образом, по содержанию ферментов готовы синтезировать биогенные амины к началу формирования симпатического ствола (3х -суточный куриный зародыш, 11-дневный зародыш кролика), когда ствол выявляется не только специальными, но и общими методами гистологического исследования. Моноаминоксидаза и ацетилхолинэстераза в клетках симпатического ствола выявляются, по нашим наблюдениям, у 11-12-дневных зародышей кролика, то есть с начала формирования отвода.
Использование нового
(Pickel et al., 1975, цит. по Teitelman), иммуногистохимического метода, подтвердило
эти результаты, ферменты, необходимые для синтеза норадреналина (тирозин гидроксилаза
и допамин-b -гидроксилаза), имеются в клетках симпатического ствола (зародыш
крысы) с самого начала его формирования (Teitelman, Joh a. Reis, 1978). Однако
накопление катехоламинов в клетках происходит, очевидно, несколько позже. Так
флюоресцентным методом Фалька (Enemar, Falck a. Hakanson, 1965; Allan a. Newgreen,
1977) они не выявлены у 3х -дневного куриного зародыша. Электронномикроскопическое
исследование показало также, что гранулы, содержащие катехоламины, обнаруживаются
в клетках симпатического ствола на пятые сутки эмбриогенеза (4х дня
инкубации!).
После сказанного неудивительно, что клетки нервного валика, не обладающие ферментами
для синтеза катехоламинов, ни при каких условиях соответствующих экспериментов
(Allan a. Newgreen, 1977) не проявляют флуоресцентной способности при использовании
метода Фалька. Авторы отмечают, что флуоресценция выявляется только в клетках
симпатического ствола, но не на более ранних стадиях эмбриогенеза.
По мнению некоторых исследователей, значение соседних эмбриональных зачатков в данном случае может быть важнее, чем влияние дифференцированных тканей, окружающих вегетативные узлы на месте (Сohen, 1972). Обнаружено, например, что дифференцировка симпатобластов зависит от присутствия мезодермальных сомитов, а также от целостности нервной трубки. Удаление вентральной части нервной трубки, например, уменьшает количество дифференцирующихся симпатобластов и при наличии сомитов. В специально предпринятых экспериментах с пересадкой участков нервной трубки зародыша на хорио-аллантоис Cohen, (1972) впервые прямо показал необходимость присутствия возле нервной трубки и ганглиозной пластинки сомитов для того, чтобы мигрирующие клетки дифференцировались, накапливая катехоламины. В эксплантатах без сомитов дифференцировки клеток, содержащих катехоламины, не наблюдалось. При культивировании клона клеток нервного валика, не имевших контакта с сомитной мезенхимой, дифференцировались только меланоциты, но не нервные клетки (Cohen а. Konigsberg, 1975, цит. по Jacobson, 1978). Необходимость присутствия сомитов и мезодермы для дифференцировки симпатобластов из клеток нервного валика установлена методом тканевой культуры и другими исследователями (Norr, 1973, цит. по Leikola, 1976). Неоднократно наблюдалось, что "энтодерма" глотки влияет на клетки валикового происхождения в жаберных дугах, где из этих клеток дифференцировался хрящ. Хрящ развивался только в присутствии энтодермы (Okada, 1955; Seno a. Nieukopp, 1958; Holtfreter, 1968; Epperlin, 1974, цит. по Leikola). Greene (1924) И van Campenhout (1935), отмечает Yntema (1937), и др. показали, что ганглий слухового нерва развивается из материала слухового пузырька. Дифференцировка ганглия происходит в присутствии развивающегося рядом продолговатого мозга (Я.А.Ванников и Л.К.Гитова, 1961).
Известны экспериментальные данные, показавшие, как указывает Cohen, необходимость присутствия нервной трубки и для дифференцировки спинномозговых ганглиев (Peterson а. Murray, 1955). Механизм действия эмбриональных зачатков друг на друга не вполне выяснен. Помочь в решении этого вопроса смогут исследования дифференцировки клеток на молекулярном и субцеллюлярном уровнях.
Вероятно, отмеченные зачатки, возле которых идет миграция клеток из нервного валика (сомиты, нервная трубка), направляют дифференцировку и тех симпатобластов, которые составляют мозговое вещество надпочечника. Симпатобласты выявляются раньше, чем они достигают места положения первичного надпочечника (Enemar, Falck a. Hakanson, 1965) и, следовательно, дифференцируются не под влиянием его коры.
С другой стороны, имеются факты, свидетельствующие о значении местных условий, окружающих структур, возле которых находятся мигрировавшие из нервного валика клетки. Так, известно, что дорсальная эктодерма влияет на дифференцировку мигрировавших из нервного валика клеток в направлении развития элементов соединительной ткани (ссылка на Bodenstein в работе Cohen'a). Из клеток нервных валиков головы кроме симпатобластов, как известно, происходят и некоторые хрящи гортани. Однако развитие хрящей не происходит, если пересадить нервный валик в другой участок тела зародыша или поместить его в условия клеточной культуры (Hoitfreter, 1968, цит. по Cohen'у).
Влияние окружающих тканей на развитие нейронов подтверждается существованием известного теперь (Levi-Montalcini a. Hamburger, 1953; Cohen a. Levi-Montalcini, 1956) фактора роста (см. Н.Е.Ярыгин, В.Н.Ярыгин, 1973; Jacobson, 1978, и др.). Фактор роста нервной ткани - это белок, обнаруженный в яде змей и содержащийся также в экстрактах подчелюстных желез мышей. Под влиянием фактора роста увеличиваются размеры нейронов и их отростков как в тканевой культуре, так и в организме. Подкожное введение фактора новорожденным и взрослым мышам привело к увеличению размеров нейронов по сравнение с контрольными животными (Н.Е.Ярыгин, В.Н.Ярыгин).
Косвенно о значении эмбриональных зачатков, которыми окружены мигрирующие пронейробласты, свидетельствуют наблюдения Weston a. Buttler (1966). Авторы показали, что при изотопических пересадках участков нервных валиков более старших куриных зародышей-доноров младшим зародышам-реципиентам и наоборот начало миграции клеток не тормозилось, но не хватало глубины их миграции в каудальном направлении. В тех случаях, когда реципиентом были старшие зародыши, развития каудальных производных не наблюдалось (использован радиоавтографический метод меченых клеток). Очевидно, для миграции необходим определенный уровень зрелости (скорее незрелости) окружающих зачатков.
Ранние стадии биохимической дифференцировки не зависят от влияния нервных волокон центрального происхождения. Появление ферментов в клетках вегетативных ганглиев предшествует образованию синапсов. Об этом свидетельствуют и литературные данные (Giacobini, 1975, цит. по Smith et al.,1977; Smith et al., 1977). Но продолжение биохимической дифференцировки нейробластов, созревание и рост нейронов находятся под влиянием преганглионарных нервных волокон (Л.И.Корочкин, 1965; Black et al., 1974, цит. по Smith, Cochard a. Le Douarin, 1977; Chiappinelli et al., 1976). Chiappinelll et al. показали, что формирование синапсов совпадает с увеличением в постсинаптических нейронах содержания ферментов, связанных с синтезом медиаторов (тирозингидроксидаза, холинацетилаза). Нарастание содержания ферментов, по мнению авторов, может быть использовано как показатель формирования синапсов.
Взаимодействие эмбриональных зачатков - один из основных факторов начальной дифференцировки тканевых элементов. Другим существенным фактором является гуморальная (гормоны и пр.) регуляция развивающихся структур. В частности, тиреоидные гормоны необходимы для развития зародыша и плаценты (С.И.Тереза и О.А.Петровская, 1936; М.Г.Закс, 1937, 1938, 1939; С.И.Тереза, 1939, 1940; М.Г.Закс и М.А.Замкова, 1947; А.П.Дыбан, I960). Тиреоидин стимулирует развитие разных тканей, в том числе и дифференцировку нейронов. Так, если мать страдала гипертиреозом, то наблюдалось ускорение дифференцировки элементов соединительной ткани кожи плода человека (В.П.Лейтан, 1964). Под влиянием тиреоидина ускоряется рост клеток здоровых тканей в культуре (Bartfelt a. Siegel, 1968; М.С.Мицкевич, 1948), ускоряется дифференцировка мионов и окружающей их соединительной ткани (З.Ф.Шавдаев, 1968, см. О.А.Завалишина и Л.В.Суворова, 1977). В растущей культуре мозжечка (Hamburgh, 1965) новорожденных крыс под влиянием тироксина наблюдалось более раннее развитие миелина в нервных волокнах (на 8-9-й день после эксплантации) по сравнению с контролем (12-14-й день). Многие исследователи (обзор в статье Л.И.Корочкина - Kоrochkin 1970; М.С.Мицкевич, 1972) наблюдали ускорение дифференцировки разных соматических нейронов у амфибий и млекопитающих в постнатальном онтогенезе. Недостаток тироксина ведет к недоразвитию центральной нервной системы вследствие нарушения миграции и дифференцировки нейронов (Smith et al., 1957; Leerand, 1961, 1965, 1967, цит. по Л.И.Корочкину, 1970; Г.Н.Московкин, 1976). Гипотиреоидное состояние ребенка оказывается причиной недоразвития головного мозга, приводящего к кретинизму. Имеются сведения о влиянии тироксина на миграцию вегетативных нейронов. Так, Coujard (1940, 1950) вводил тироксин головастикам Alytes abstetricans, лишенным в норме подслизистого нервного сплетения, и через 40 часов наблюдал образование нервно-клеточных тяжей, простирающихся от мышечного сплетения в направлении к подслизистой основе. Через 6 дней после введения тироксина подслизистое сплетение оказалось полностью развитым. Нами не обнаружено изменений в дифференцировке интрамуральных ганглиев у зародышей 15-19-дневного возраста. У новорожденных крольчат во всех обследованных органах наблюдалось ускорение дифференцировки нейронов, которое выразилось в увеличении количества дифференцированных мультиполярных нейронов. Такие нейроны обладают несколькими отростками, среди которых часто выделяется уходящий на большое расстояние от перикарионов нейрит. Ядро обычно расположено эксцентрично, цитоплазма расположена у ядра в виде широкой зоны и имеет неровные контуры. В цитоплазме клеток находятся тонкие нейрофибриллы и нисслевская субстанция.
Эффект действия тироксина проявляется и в незначительном увеличении общего количества клеток в ганглиях мышечно-кишечного сплетения, что может быть обусловлено как стимуляцией размножения клеток-предшественников (пронейробластов), так и ускорением дифференцировки пронейробластов в нейробласты, а последних в нейроны. Однако вопрос об увеличении количества клеток требует дополнительных наблюдений и экспериментов.
Приведенные данные показывают, что тироксин оказывает влияние на дифференцировку нейронов, рост их цитоплазмы, который обусловлен синтезом белков. Основной рост нейронов и дифферениировка их из нейробластов происходят в интрамуральных ганглиях, как и в центральной нервной системе, в постэмбриональном периоде. В это время особенно важно присутствие в организме достаточного количества тироксина. У гипотиреоидных животных снижена скорость включения меченых аминокислот в белки клеток головного мозга (наблюдения на крысах Greel et al., 1967, цит. по Г.Н.Московкину и Е.Н.Санковой, 1974). В условиях гипотиреоза снижена интенсивность белкового синтеза и уменьшено, вследствие этого, количество синтезированных белков в нейронах головного мозга у новорожденных животных и в первые недели после рождения (Г.Н.Московкин и З.Х.Приймак, 1970; Г.Н.Московкин и Е,Н.Санкова, 1974). Эти наблюдения показывают значение тиреоидина для синтеза белков в клетках и подтверждают высказанное в таком плане предположение Гамбурга (Hamburgh, 1955, цит. по указ, авторам). Таким образом, несомненно, гормоны щитовидной железы необходимы для нормальной диффе-ренцировки нейронов. С этим согласуются и сроки начала функционирования щитовидной железы зародыша. Железа выделяет секрет у кроликов после 20-го дня эмбриогенеза, когда в интрамуральных ганглиях (по нашим данным) появляются дифференцированные нейроны.
У 18-дневных зародышей кролика щитовидная железа синтезирует главным образом низкомолекулярный тиреоглобулин, который начинает полимеризоваться лишь с 22-го дня развития зародыша (Ю.А.Панков, 1971). Lissitzky и др. (1970, цит. по Ю.А.Панкову) показали, что способность клеток щитовидной железы зародышей кролика йодировать тиреоглобулин связана с появлением в них к 28-му дню цитоплазматического ретикулума. У куриного зародыша железа закладывается на 6-й день инкубации, у 8-дневного зародыша отмечен внутриклеточный коллоид, а с 12-го дня коллоид содержится в сформированных фолликулах и выделяется в кровь (А.Н.Студитский, 1941). В этот период, по нашим данным, начинается и рост интрамуральных нейронов. У зародыша человека то и другое наблюдается в 3 х-месячном возрасте.
Отсутствие в наших наблюдениях эффекта действия тироксина у зародышей кролика до 20-го дня эмбриогенеза объясняется, очевидно, непроницаемостью плацентарного барьера в это время. М.С.Мицкевич (1957) указывает, что плацента кролика становится проницаемой на стадии около 24-25 дней беременности. Специальные эксперименты Myant (1958) с меченым тиронином показали, что экзогенный тироксин от матери к плоду у кролика до 19-го дня беременности проходит очень медленно. Концентрация йодированного белка в сыворотке зародыша становится эквивалентной концентрации его в материнской крови не раньше 27-го дня эмбриогенеза. М.С.Мицкевич (1957, 1962, 1977) полагает, что гормон щитовидной железы из материнского организма проходит через плаценту в тот период, когда начинает вырабатываться собственный гормон у зародыша, т.е. после 20-го дня эмбриогенеза. Проникновение тироксина через плаценту на поздних этапах эмбриогенеза отмечено у других млекопитающих и у человека (Sobel, Hamburgh a. Koblin, I960; Crumbach a. Werner, 1956). Наблюдения Грумбаха и Вернера показали слабую проницаемость плаценты человека для тироксина и усиление ее проницаемости перед родами.
Установленная нами необходимость наличия тиреоидных гормонов для дифференцировки нейронов в период их роста согласуется с современным представлением о механизме действия тироксина. Клетки чувствительны к тироксину с определенного момента, когда в них имеется достаточный уровень РНК (В.И.Архипенко, А.И.Спица, Л.В.Гербильский, В.М.Пинская, 1971), когда в них появляется тироксин-связывающий рецепторный белок. Тироксин непосредственно участвует в регуляции синтеза и-РНК и цитоплазматических белков, повышая матричную активность хроматина (А.А.Войткевич и Г.З.Нестайко, 1971; В.И.Архипенко и Л.В.Гербильский, 1977; А.А.Нейфах и М.Я.Тимофеева, 1978; В.И.Архипенко, В.М.Пинская и др., 1979).
Таким образом, на
равных стадиях эмбриогенеза развитие вегетативных ганглиев зависит от различных
экзогенных по отношению к клеткам факторов. Гормональный режим, в частности,
гормоны щитовидной железы, оказывает влияние на поздних стадиях пренатального
и особенно в постнатальном периоде онтогенеза, когда происходит интенсивный
белковый синтез в дифференцирующихся нейронах, приводящий к интенсивному их
росту.
Для выяснения вопроса о влиянии тироксина на миграцию клеток-предшественников
симпатобластов необходимы наблюдения не на плацентарных животных, чтобы исключить
тормозящее действие плацентарного барьера.
Необходима всесторонняя
разработка проблемы гормональных влияний на дифференцировку нейронов, которая
имеет большое теоретическое и практическое значение для медицины.
Иначе говоря, рассмотренные здесь факторы дифференцировки нейронов свидетельствуют
об изменении, смене регуляторных механизмов в процессе эмбриогенеза. Это подтверждается
и специальными экспериментальными наблюдениями над развитием вегетативных ганглиев
in vivo и in vitro (Coughlin, Boyer, Black, 1977).
Для развития нервных элементов, несомненно, имеет значение и функциональный фактор. Наше наблюдение над развитием моторных бляшек пищевода кролика показало, что форму бляшки нервное окончание приобретает только в первые дни (с 3-го дня) после рождения, когда начинается функция пищевода. Известны и литературные данные (см. предыд. раздел), которые показывают увеличение количества компонентов бляшки в скелетных мьшцах с усилением их функции.